【临床研究】黄连联合益生菌改善去卵巢肥胖大鼠左心功能的研究
编辑:管理员   发布时间:2018-08-16 15:29浏览量:134

作者:吴波 刘彦等  中华肥胖与代谢病电子杂志


摘要


目的:用黄连、二甲双胍、益生菌等对去卵巢肥胖大鼠模型进行干预,观察干预后模型大鼠的代谢指标、左心功能的变化,探讨黄连联合益生菌对去卵巢大鼠的体重、代谢有关指标、左心功能等的作用和可能机制。

方法:用40只雌性大鼠,分5组,去双侧卵巢手术后高脂饮食诱导建立去卵巢肥胖大鼠动物模型。分别用二甲双胍、益生菌、灭菌去离子水、黄连联合益生菌灌胃6周(假手术高脂喂养灭菌去离子水灌胃组:缩写为HFSS;去卵巢手术高脂喂养灭菌去离子水灌胃组:缩写为HFOS;去卵巢手术高脂喂养黄连益生菌合剂灌胃组:缩写为HFOH;去卵巢手术高脂喂养二甲双胍灌胃组:缩写为HFOM;去卵巢手术高脂喂养益生菌灌胃组:缩写为HFOB)。测量各组大鼠试验前后的体重,Lee指数;用床边 超声心动图测定各组左心功能;处死后测量各组心脏等内脏重量。

结果:去卵巢手术术后高脂喂养4周后,去卵巢手术组和假手术组的大鼠体重出现差异(P<0.05);继续高脂喂养并同时灌胃干预6周后,即术 后高脂喂养第10周,各组体重均有明显增加,HFOH组体重增加最慢,HFOM组和HFOB组体重增长较慢,HFOS组体重增长最快;各组大鼠的Lee指数较第1周均有增加,其中最明显的是HFOS组和HFOB组;超声心动图检查显示,HFOH组左心功能指标LVDS和LVESV较HFOS组有明显下降,EF、FS较HFOS组有明显上升;术后高脂喂养第12周处死大鼠称量内脏器官显示,HFOH组的心脏重量最小。

结论:黄连、二甲双胍、益生菌对去卵巢高脂饮食诱导肥胖大鼠均有抑制体重快速增加和改善Lee指数增长的作用。其中,黄连联合益生菌干预后,去卵巢肥胖大鼠的左心功能指标改善作用最明显,心脏重量最小。


关键词


去卵巢肥胖大鼠; 黄连; 益生菌;

 左心功能; Lee指数


前言


绝经女性在高脂饮食的影响下,更容易出现肥胖和罹患糖尿病和心血管疾病[1,2],这一结论在对东、西方女性人群的研究中显示出了一致性[2,3]。激素替代治疗虽然可以改善更年期肥胖,降低心血管风险[4],但长期使用有增加子宫内膜癌和乳腺癌等肿瘤的风险[5,6]。关于激素替代治疗的争议从2002年以来争议不断。近年来,肠道菌群已被证实与代谢和肥胖密切相关[7,8]。已有研究表明,乳酸菌等益生菌可以通过激活AMPK→SREBP-1c/PPARα 信号通路,改善高脂诱导肥胖大鼠的胰岛素抵抗和相关的脂代谢紊乱[9],而经乳酸发酵的一些天然食品也可以通过调节肠道菌群的结构和功能而调节去卵巢大鼠的代谢状态。有实验发现常被用于改善更年期症状的异黄酮也是通过作用于肠道微生物发挥作用[10]。这些研究结果都提示了,肠道菌群的修饰和干预可能成为干预更年期肥胖的新靶点。传统中药黄连长期被用于更年期综合症治疗的临床实践中[11,12],目前已有研究显示,黄连及其主要成分小檗碱有明显减轻胰岛素抵抗、减重、改善代谢、抗炎、抗肿瘤、心血管保护作用[13-16],且黄连和小檗碱改善代谢的作用也是通过作用肠道菌群实现的[17,18]。但目前黄连和益生菌对更年期雌激素下降相关的肥胖和代谢紊乱及继发的心血管疾病是否有协同保护作用的研究甚少。本研究通过建立去卵巢肥胖大鼠的动物模型,进一步探讨黄连联合益生菌对去卵巢大鼠的体重、代谢有关指标、左心功能等的作用和可能机制。


资料与方法


一、一般资料

1.试验动物及分组

10~12周健康未孕雌性SD大鼠40只,购于北京维通利华动物技术有限公司实验动物中心,SPF级,体重210~230 g,实验动物质量合格证号:11400700167937,动物实验许可 证:SYXK(苏)2016-0018。动物实验人员证书编号:2161797。每5只大鼠放入一笼饲养,室温(25±0.5)℃,12 h昼/夜周期,普通大鼠饲料,自由取食和饮水,适应环境饲养14 d。

2.主要试验设备和试剂

通风大鼠笼,NO:2012081817,苏州猴皇动物实验设备科技有限公司;立式自动压力蒸汽灭菌器(GP110DF);床边超声心动 图(GE Systems, Hayozma,Tirat Carmel,Israel);水合氯醛,生产厂家:国药集团化学试剂有限公司,批号:20121204;青霉素,生产厂家:山东鲁抗医药股份有限公司 400万U/ 瓶,批号国药准字H37020081;4%多聚甲醛生产厂家:国药集团化学试剂有限公司,批号:20121204;盐酸二甲双胍0.5g×20,天津施维雅公司。炒黄连,购自江苏省中西医结合医院中药房,产地:生产批号: 国药包字20140588。产地:毫州市谯城区西关秦庄路北,毫州市万珍中药饮片厂。益生菌:嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)每克0.5×1011CFU,乳双歧杆菌(bifidobactrium lactis)每 克0.5×1011CFU(上海昊岳食品科技有限公司)。


二、方法

1.大鼠双侧卵巢切除术[19]

大鼠称重后,按大鼠体重每100 g需要0.3 ml水合氯醛进行腹腔麻醉后,局部备皮消毒,从一侧腹部逐层切开至腹腔,并牵拉出输卵管和卵巢。假手术组不做卵巢切除,牵拉出的输卵管和卵巢放回腹腔后逐层缝合;手术组用无菌手术缝线在卵巢靠近输卵管侧结扎后切除卵巢。留取切除的卵巢放入装有4%多聚甲醛的标本管送病理,止血后将输卵管接扎后部分放回腹腔,逐层缝合。相同步骤处理另一侧卵巢。手术后分笼饲养3 d,每天肌肉注射青霉素8万U/鼠×3d。3d后无手术创口裂开等情况,合笼饲养。

2.高脂喂养诱导肥胖双侧卵巢切除大鼠

糖、脂肪20%,蛋黄粉5%,基础料55%。(2016年江苏省中医药研究所高脂饮食配方推荐,由南京安立默科技有限公司加工),从手术后第2天开始换用高脂饮食喂养至实验结束,每周称重,测量体长,测空腹血糖,实验前后留取眼眶血和大便标本。每周称重所有实验大鼠的体重,为准确测量大鼠体长,并分别在手术当天和术后高脂饮食喂养10周后麻醉状态下测定所有实验大鼠的体长,进行Lee指数分析。

3.大鼠左心功能测量方法

提前联系心脏科专科医生进行预实验。逐一称重后,用10%水合氯醛腹腔麻醉后胸前备皮,将大鼠仰卧位置于提前加热至25℃的加热平板上。提前预热超声用耦合剂,避免低温对胸部无毛的大鼠造成刺激,避免影响心功能检查结果。采用以色列便携式GE ViVid-q 超声系统,使用8L-RS型超声探头, 频率为13 MHz,于胸骨旁左室乳头肌水平短轴采集M型超声图像,两维图像最小设置深度为2 cm,测量切面和参数测量方法示意图见图1。M型波谱以扫描速度为200 min/s成像以供离线分析。分别在舒张期测量IVSd,LVPWd,LVEDD参数,在收缩期测量LVESD参数各三次,取平均值。缩短分数(FS)和射血分数(EF)使用M模式固定方程用上述参数进行计算得出。


三、实验流程

将所有大鼠分为手术组和假手术组,两组大鼠在手术后均用高脂饮食饲养,分别称为高脂喂养手术组(High-fat feeding operation group,HFO)和高脂喂养假手术组(High-fat feeding sham operation group,HFS),高脂喂养4周后,将HFO随机分为四组,分别用二甲双胍水溶液(HFOB组),益生菌水溶液(HFOM组),黄连煎剂(HFOH组),高压灭菌去离子水(deionized water,DD)(HFOS组)进行灌胃。HFS组用高压灭菌DD水灌胃,简称为HFSS。所有组的大鼠每日灌胃一次,继续高脂饮食喂养并同时灌胃6周后(即高脂喂养10周后)行左心功能测定试验,功能实验2周后(即高脂喂养12周后)行颈椎脱臼法处死,取组织标本。建模和干预分组过程详见图2。





四、各组灌胃药物浓度和配制

1.对照组灌胃液

灭菌DD水,制作方法:取5000 ml DD水,高压蒸汽灭菌 120℃*20 min后自然冷却至室温。作为HFSS组和HFOS组的灌胃液,每只大鼠每天灌胃2 ml。同时作为其他组灌胃液的溶媒。

2.黄连煎剂的古法煎制和主成分测定

按照中药传统煎煮方法[20],进行三煎,得药液 600 ml,不足600 ml加去离子水煮沸补足600 ml,将 黄连药材浓缩成含生药0.367 g/ml的汤剂。自然冷却后放入4℃冷藏库备用。研究表明,常温与冷藏条件下,上述代煎中药保存至第4周时,药液成分开始出现变化,中药煎后煎剂的保质期以3周内为宜[21]。故每三周重新配制一次上述煎剂。采用HPLC法[22], 测定本研究中所用黄连药材中小檗碱和黄连碱的含量,可知本研究所用黄连灌胃煎剂内小檗碱浓度为:13.21 mg/ml,黄连碱浓度为:7.34 mg/ml。

3.二甲双胍灌胃溶液的配制

精确称量二甲双胍片10 g在灭菌研钵中研碎至均匀粉末状,转移至186 ml灭菌DD水中,搅拌涡旋使其充分溶解,得到浓度为54.28 mg/ml的二甲双胍工作液。根据大鼠体重,计算并用灭菌DD水调整至每只大鼠2 ml/d,故二甲双胍的大鼠灌胃量为104mg/kg/d。

4.益生菌和黄连煎剂混合灌胃溶液的配制

按文献报道[23]益生菌灌胃溶液低剂量组确定益生菌每天灌胃量:78 mg/kg/d进行计算。益生菌冻干粉1g含有:嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus) 每 克0.5×1011CFU,乳 双歧杆 菌(bifidobactrium lactis)每克0.5×1011CFU (上海昊岳食品科技有限公司惠赠),溶于自然冷却的600 ml的黄连煎剂中,涡旋至溶解,得到益生菌和黄连煎剂混合灌胃溶液, 放于4℃冷藏柜中备用。故益生菌和黄连煎剂混合灌胃溶液中益生菌含量为10.92 mg/ml,其中嗜酸乳杆菌55×107  CFU/ml,乳双歧杆菌55×107  CFU/ml,黄连生药浓度为367 mg/ml。每周重新配置益生菌和黄连煎剂混合灌胃溶液。灌胃前摇匀。


五、统计学分析

应用SPSS 11.0 统计软件进行分析。服从或近似正态分布的计量资料以(x±s)表示,正态分布的数值资料采用配对样本的t检验;不符合正态分布的数值资料采用配对样本的非参数检验(Wilcoxon 符号秩检验),多组组间比较采用单因素方差分析, 用Levene法进行方差齐性检验,若方差齐,组间两两比较采用LSD-t检验,若方差不齐则采用组间两两比较Games-Howell方法。P<0.05为差异有统计学意义。

 

结果


一、大鼠体重变化情况

所有大鼠在术后高脂喂养10周内均显示出体重和Lee指数的明显增长。术后高脂喂养4周后,手术组(HFO)和假手术组(HFS)大鼠体重增加开始表现出统计学差异,详见图3。并持续至术后高脂喂养10周后,体重增加的组间差异稳定,见表1。




二、大鼠Lee指数变化情况

Lee指数的测量公式参照文献,Lee指数=体重(g)^(1/3) /鼻尖至肛门体长 (cm),可反映成年大鼠的肥胖程度[23]。各组大鼠在术后高脂喂养10周内, 均显示出Lee指数明显增长。术后高脂喂养第10 周,HFSS、HFOM、HFOH组Lee指数均低于HFOS 组(P<0.05),其中,HFSS、HFOH组Lee指数最低。HFOM组Lee指数明显高于HFSS组(P<0.05)。HFOB 组Lee指数明显高于HFOH组(P<0.05),详见表2。



三、干预实验后各组大鼠左心功能的变化

术后高脂喂养10周后,用床边超声心动图测定五组大鼠的左心功能指标:左室收缩末期直径(left ventricular end systolic diameter,LVDS),等指标,详见下表3。可见,HFOM、HFOB和HFOH组的LVDS 较HFOS组明显减 少(P<0.05),其 中HFOH组 减少最多,见图4。HFOS组大鼠的LVESV较其他组的LVESV有 明显增加。HFOM、HFOB和HFOH组的LVESV较HFOS组明显减少(P<0.05),HFOM、HFOB组和HFSS组间无统计学差异,HFOH组的LVESV较HFSS组有明显降低减少(P<0.05),见图5。HFOS组的大鼠FS和EF都最低,HFOH组的大鼠的FS和EF都是最高,和其他组均有统计学差异,HFOM组,HFOB组大鼠的FS和EF较HFOS组有明显改善(P<0.05),和HFSS组相当,见图6、图7。




讨论


围绝经期动物模型常见的有自然衰老模型、卵巢摘除动物模型、X线照射破坏卵巢动物模型等[24]。由于时间和成本的限制,动物实验3R原则和实验伦理的要求[25],去卵巢高脂诱导肥胖大鼠模型在围绝经期代谢紊乱的基础实验研究应用最为广泛。既往研究显示,高脂喂养去卵巢肥胖大鼠雌激素水平降低,脂代谢紊乱,心肌线粒体功能损害加重[26,27],这和人类女性围绝经期出现肥胖、代谢紊乱、心功能减退等围绝经期综合症等病理生理过程相似。本研究建立的高脂饮食诱导双侧卵巢切除大鼠的动物模型,假手术组和手术组之间在术后4周即出现显著的体重差别,并在实验过程中这种差别保持稳定。术后第10周的阳性对照组(HFOS组)大鼠的Lee指数显著高于其他组,而左心射血分数和左室缩短分数较其他组明显下降,同时左心功能指标LVDS,LVESV明显增高,提示左室肥厚和左心室重构,和既往研究中认为代谢紊乱导致的心脏代谢性重塑观点相一致[28],且和既往研究雌激素剥夺导致高脂喂养的肥胖大鼠心肌损害加重的结果一致[27]。说明本研究中建立的去卵巢肥胖大鼠动物模型表型稳定显著,出现了明显的左心功能下降,符合进一步干预研究的需要。

 

应用黄连联合益生菌、二甲双胍、益生菌和对照溶媒分别灌胃干预后,和HFOS组相比,各组大鼠都出现体重增加趋势减缓和肥胖指数改善的变化,其中以黄连联合益生菌组效果最显著。曾有研究显示,雌激素替代治疗对去卵巢肥胖大鼠左心功能的改善作用显著,而二甲双胍并没有显示类似改善作用[29],但同时有研究显示,二甲双胍对雌激素剥夺的胰岛素抵抗大鼠的肥胖和高胰岛素血症有明显改善作用[30]。故在本研究设计中将二甲双胍(HFOM组)作为心功能作用的阴性对照,同时也作为改善代谢的阳性对照,HFSS组既是手术对照组,也是雌激素未剥夺的阳性对照组,以节省实验动物。但在本研究中,仍然显示了二甲双胍对模型大鼠有一定的左心功能保护作用,但不优于雌激素未剥夺组。这可能与本研究动物样本量较小及既往实验中应用外源性雌激素替代剂量不同有关。

 

既往动物实验报道,益生菌(尤其是乳杆菌和双歧杆菌)具有良好的改善代谢综合征的功效[31],乳杆菌和短双歧杆菌可显著抑制高脂饮食诱导肥胖大鼠的体重增加,对非酒精性脂肪肝有良好的改善作用[32]。但在小样本的临床随机对照研究中观察到了相反结果,在肥胖青少年中,益生菌干预不仅轻度增加体重和肥胖度,也没有显著改改善脂肪肝[33]。在本研究中结果提示,在高脂诱导去卵巢肥胖大鼠模型中,益生菌组虽有一定的抑制模型大鼠体重增加的效果,但和雌激素未剥夺组相比有明显增加,益生菌干预组的大鼠Lee指数也没有明显降低,而和HFOS组相近。这提示益生菌在调节代谢和改善肥胖的作用和机制还需要进一步研究。

 

黄连味苦,性寒,归心、脾、胃、肝、胆、大肠经,为毛茛科植物黄连,三角叶黄连,云南黄连的干燥根茎,具有清热燥湿,泻火解毒的功效。随着分离鉴定技术的进步,黄连中含有的多种有效成分被逐一分离和鉴定出来,包括多种生物碱,主要为黄连素(即小檗碱),还含有黄连碱、甲基黄连碱、巴马亭、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、木兰花碱等,其他非生物碱成分还包括木脂素、黄酮、酚酸等[34]。动物实验已证实,黄连及各生物碱组分能明显抑制小鼠体重增长[35],同时改善糖代谢、调节血脂、减轻胰岛素抵抗、抑菌抗炎、免疫调节、抗肿瘤[36-38]。目前主要观点认为,黄连及其所含的有效成分这种强大的调节代谢和抗脂毒性作用是通过两条途径实现的。一个是抑制脂多糖刺激的IL-6的释放,抑制脂多糖介导的NF-KB的激活[39],另一个是激活MOLT-4细胞和1型辅助型T细胞,通过激活抗有丝分裂原激活的蛋白激酶(MARKs)通路增强1型辅助型T细胞释放免疫因子[40]。同时,黄连的主要成分小檗碱可通过激活AMPK通路,上调缺血心肌的蛋白激酶的浓度,抑制ATP的消耗,刺激细胞产生更多的ATP,延长细胞内ATP的供应时间来实现心肌的保护作用,同时通过抑制PI3K/AKT通路减少缺血性心肌再灌注损伤[41,42]。新近研究更显示了传统中药黄连及其组分可通过作用于肠道菌群实现调脂,影响代谢过程[43,44],这进一步解释了在本研究中,黄连联合益生菌缓解高脂诱导去卵巢大鼠体重增加和Lee指数增加的方面,表现为协同作用的可能机制。在干预实验结束后大鼠的内脏称重中可知,黄连联合益生菌干预组的心脏重量最轻,显著低于其他组,这也提示了黄连和益生菌的联合干预可能影响了去卵巢肥胖大鼠的心肌的代谢过程。

 

结论


黄连和益生菌的联合干预在本研究中显示了对去卵巢肥胖大鼠的肥胖指数,体重增加的明显改善作用,对左心功能有明显保护作用,其机制可能和黄连的肠道菌群调节作用有关,值得进一步研究,为临床更年期肥胖和左心功能损害的干预提供了新思路和新靶点。


参考文献


略。



(本文编辑:郭菲菲 范美龄)